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PCR技术概述

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是基因扩增技术的一次重大革新,是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。使用PCR扩增技术,可以将极微量的靶DNA片段特异地扩增上百万倍,大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点,在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。

耐热DNA聚合酶的应用是PCR技术的核心。根据是否具有3’→5’端外切酶活性,耐热DNA聚合酶通常分为无校读活性和有校读活性两类。无校读活性的DNA聚合酶(以Taq 酶为代表)具有较高的扩增效率,但由于缺乏校读活性,容易发生碱基错配,故产物中点突变较多。Taq DNA聚合酶还具有末端转移酶活性,可在PCR产物的3’末端非特异地添加碱基,因单个A突出碱基的比例最高,故PCR产物可直接与含有3’末端突出T碱基的载体连接(即TA克隆),方便PCR产物的克隆、扩增和测序。然而,Taq DNA聚合酶在PCR反应第一步升温过程中即可催化错配引物延伸或引物二聚体形成,因而导致非特异性扩增,影响目的片段的合成量。针对这一现象设计的热启动Taq DNA聚合酶,在低温时其聚合酶活性被抑制,通过高温变性,聚合酶的活性恢复,催化特异性结合的引物扩增,因而提高了目的片段的特异性和产量。另一类有校读活性的DNA聚合酶(以Pfu为代表)可选择性地去除错误掺入的dNTP,维持DNA链的正确延伸;然而其扩增效率通常低于Taq DNA聚合酶,特别是对于长片段DNA链的延伸能力较差。基于上述两类酶的特点,可将适量的Taq DNA聚合酶与任意一种有校读活性的DNA聚合酶混合,在适当的反应缓冲液体系中,可获得保真性与扩增性能介于上述两类酶之间的混合酶,用于长片段以及复杂模板的高保真扩增。

PCR实验受诸多因素的影响。优质的商业化耐热DNA聚合酶及其配套缓冲液通常可以满足绝大多数DNA片段扩增的需要。首先应根据模板的性质(基因组、cDNA、质粒等)和目的片段的大小、GC含量、有无二级结构等,选择合适的DNA聚合酶(参见GenStar PCR产品选择指南)。对于难于扩增的片段,应针对不同的模板、引物,优化反应条件,以获得最佳的扩增效率(详见“常规PCR反应的优化方法)。

A. 模板用量:以50 μl反应体系为例
• 人基因组DNA:0.1~1.0 μg
• 大肠杆菌基因组DNA:10~100 ng
• λ DNA:0.5~5 ng
• 质粒DNA:0.1~10 ng

B. 引物设计原则:
• 引物长度要满足特异性需要,一般可在18~25个碱基之间;扩增长片段时最好在24~30个碱基之间;
• (G+C)%含量应尽量控制在40~60%,两条引物的(G+C)%含量应尽量接近;
• 尽量避免相同碱基连续出现三次以上,3’端应避免使用A或T;
• 避免引物内部自身配对形成二级结构;
• 正反向引物之间应避免配对碱基,尤其是3’端的三个碱基,否则易生成引物二聚体(Primer dimer);
• 两条引物的Tm值应尽量接近,最好相差不超过5oC;
• 引物Tm值的计算方法:
20 nt以下:Tm = 2x(A + T)+ 4x(G+C)
20 nt以上:Tm = 81.5+0.41x(G+C%)-600/nt(nt:引物的碱基数)

C. 引物用量:
• 0.1~1.0 μM,通常可以0.2 μM起始,根据体系不同调整用量;
• 使用简并引物、随机引物时,需增加引物总量以弥补产量损失;但随着引物量加大,特异性将降低;
• 模板较大较多,或结构较复杂(如人基因组DNA)时,需减少引物用量以提高特异性;
• 模板较小较少(如质粒模板)时,增加引物用量可提高产量。

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