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T170 EZ-Blunt™ Blunt-end Cloning Vector
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T170-101
20 µl
230
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230

EZ-Blunt™ Cloning Vector是高效、便利的平末端PCR产物克隆专用载体,适用于与由Pfu、Pwo、Vent或KOD等高保真DNA聚合酶催化反应的PCR产物直接连接,以利于下一步克隆或测序。本载体是基于pBlueScript II SK(+) 质粒,经EcoRV酶切、纯化等处理后获得的具有平末端碱基的线性载体,不含NdeI或NcoI限制性内切酶位点,故可用于克隆含上述酶切位点的基因。进行连接反应时,可通过在反应液中添加少量EcoRV限制性内切酶以阻止载体自身环化,提高插入片段的连接效率。严格按本说明书操作,蓝斑率可低于30%,白斑含插入片段的阳性率可达90%以上。克隆含有EcoRV酶切位点的平端PCR产物时,连接反应液中不可加入EcoRV,因此白斑率较低。DNA测序建议使用M13 Forward和M13 Reverse或T7 promoter和T3 promoter 通用型引物。

用途
• 无EcoRV位点的平末端PCR产物的克隆和测序
• 利用载体的酶切位点进行亚克隆
• 利用lac promoter进行基因表达
特点
• 方便快捷: PCR产物无需加磷酸反应,直接连接
• 无NdeI或NcoI位点,便于重组表达基因的亚克隆
• 提供纯化的PCR片段作为阳性质控对照
• 蓝白筛选:高表达活性的β-半乳糖苷酶,显色更快更深
• 批次稳定:遵循标准化生产流程,经过严格的质量检测

产品组分

EZ-Blunt™ Cloning Vector 40 ng/µl 20 µl
EZ-Blunt™ Control Insert 40 ng/µl 5 µl
EZ-Blunt™ Ligase 20 µl
10 x Ligation Buffer 20 µl x 4

保存条件

-20℃恒温保存一年

EZ-Blunt™载体环形图谱


EZ-T™载体的多克隆位点区序列

使用方法
1.按插入片段与EZ-BluntTM载体的摩尔比为3~10:1配置连接反应体系
2. 25oC反应2小时, 37oC加热15分钟
3.转化:取2 µl连接反应液加入至50 µl感受态细胞中,冰中放置30分钟
4. 42oC加热45秒,冰中放置2分钟
5.加入800 µl SOC或LB培养基, 37oC 250 rpm振荡培养60分钟
6.在含有X-gal、 IPTG、 Amp的LB琼脂平板培养基上37oC培养过夜
FAQ
Q1:使用EZ-BluntTM载体克隆对PCR产物有何要求?
A1:首先, PCR应使用高保真DNA聚合酶(如Pfu、Pfx、Pwo、Vent、Phusion、KOD等)以确保扩增的PCR产物为平末端。使用无校
读活性的DNA聚合酶(如Taq或Tth)扩增的PCR产物不应使用EZ-BluntTM载体,但可直接克隆到EZ-TTM载体( Cat No. T168-
10)中。其次, PCR片段最好经过胶回收纯化,去除非特异性产物、残留引物、dNTPs、引物二聚体等,否则影响克隆效率。
Q2:含有EcoRV酶切位点的PCR产物能否直接克隆到EZ-BluntTM载体中?
A2:需要用其他DNA连接酶替代本试剂盒提供的EZ-BluntTM连接酶,并且多筛选一些克隆以去除载体自连的干扰。另一种
高效的克隆方法是将EZ-BluntTM载体去磷酸化处理,而将PCR产物进行5· 末端磷酸化处理后将二者连接。
Q3: EZ-BluntTM载体能否用于克隆酶切制备的平末端DNA片段?
A3:可以,但最好是对载体进行去磷酸化处理,然后再连接,可显著提高阳性克隆效率。对于含有EcoRV酶切位点的DNA
片段,应换用其他品牌的DNA连接酶。
Q4: EZ-BluntTM载体与插入片段能否使用预混的快速连接反应体系?
A4: 使用预混的快速连接反应体系连接平末端效率较低,因此建议使用适合于平末端连接的酶。
Q5: EZ-BluntTM连接反应产物是否能进行电转化?
A5:使用EZ-BluntTM连接试剂盒中提供连接反应试剂得到的产物可以不经过纯化,直接进行电转化。
Q6: EZ-BluntTM Ligation Kit应如何保存?
A6:应于-20oC保存。10x连接酶反应缓冲液由于含ATP,对温度变化非常敏感,因此融化和使用过程中应置于冰上,单次用量
小,应予分装。 EZ- BluntTM载体和插入DNA对照可耐受10次左右冻融,应避免长时间放置于室温状态以及反复冻融。

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