如何证明反转录第一链cDNA成功了?
发布时间:2021-11-02

这个问题出自XXX领导之口

那小编我着实需要好好捋捋


为此小编我整日抓耳挠腮

百思不得其解

按理来说,RNA的质量没问题(28s和18s rRNA是否清晰、明显,亮度比符合2:1),那么RT产生的cDNA一般是不会出现问题的。但是偏偏有那么些个博学多才、才高八斗的抖机灵们想要一探究竟!

作为2G冲浪选手,小编我也机灵了一回


听听学霸网友们的声音

一号学霸:

一般可以用电泳检测是否合成适当大小片段的带,这方法看cDNA大小没问题(自信);如果想看碱基那当然还是测序或者使用探针检测,就是比较麻烦(一如既往的自信)


二号学霸:

cDNA的质量不好判断,因为cDNA产物是smear,所以只能根据smear的分布范围大概估计cDNA的质量,分布范围越大越好。但是,电泳看到的smear因为还和加样量相关,所以即使没有看到分布很广的cDNA一链,也并不等于它不存在(淡定如斯)


三号学霸:

用PCR检测合成的cDNA中管家基因的量,如果出现比较好条带,基本可以证实你的cDNA没有问题,我们实验室一直这样控制(众人)


四号学霸:

如果不怕烦的话,可以在反转第一链时加入少量同位素标记的dNTP,然后看一下放射比活度或做个放射自显影(别出心裁)


五号学霸:

首先看你用什么方法合成cDNA,如果随机引物合成,三号的建议可以考虑(因为管家基因片段多数较短)。如果是LD PCR,则这些内参可能无法检验结果的好坏(有条有理)


六号学霸:

ds cDNA检测我倒是做过(LD PCR),理论上由总RNA起始的,哺乳动物应该1.2%浓度的琼脂糖凝胶于0.5~6kb(可达10kb以上)有明显的smear,且有一些明显的亮带(脑、脾、胸腺除外)(过来人代表)


七号学霸

做内参照啊!如GAPDH,β-actin,β-MG等(言简意赅)


.........(好多学霸,真好!)


么多学霸出谋划策,你,懂了吗?

为了防止有人和小编一样可爱,英语、术语分不开,我先来解释一下:

Smear:弥散带

LD PCR:全称Long Ditance PCR即长片段PCR

ds cDNA:指依靠DNA聚合酶,与cDNA相互补的第二链cDNA


小编给大家做了总结,请各位霸霸查收~

选择试剂盒:您做RT实验想得到什么样的产物呢?

产品推荐

不含RNase H(合成长度更长)


预混组分(简单高效快捷)


一步法(轻松得到双链cDNA)


 如何检测第一链cDNA合成成功? 

cDNA电泳检测(大多数学霸推荐,简单快速,但需注意特殊情况)

       取约5ul反应产物,在1%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,紫外成像检测,呈现出大小在200-10Kb的拖带,其中重心区域小1-4Kb之间,这说明反转录完全,得到了高质量的cDNA(如果RNA丰度低,电泳也可能是无产物,但是这种情况不代表PCR会无结果)。


cDNA测序(受限较多,但结果精准)

       全长双链cDNA做分子克隆实验,然后通过测序结果精确判断。

a.  Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解决poly(A) mRNA模板限制和长度限制的问题

b.  序列特性引物可获得你想要得目的序列


探针检测(相对较麻烦,但结果较精准)

       qPCR或RT-qPCR步骤


管家基因/内参基因(引物类型限制,适用范围受限)

       以反转录产物为模板,扩增内参基因,扩增有结果,说明cDNA的质量基本可以保证,这个方法限制于随机引物扩增(因为管家基因片段多数较短)。

       而Oligo(dT)18与序列特异性引物扩增或我们做LD PCR(2kb、10kb等长片段)时,这些内参扩增的几率远大于全长或大片段cDNA的扩增,这时可能就无法通过内参来检验cDNA扩增结果的好坏。


同位素标记

       反转录中加入少部分同位素标记的dNTP

       放射比活度或放射自显影检测

联系方式

电话:400-666-3332

邮箱:info@gene-star.com

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