RT-PCR FAQs
下载热度:1771 次更新日期:2020-02-13

1.   1. 如何证明RNA反转录cDNA第一链成功?

方法1——以反转录产物为模板,扩增内参基因。理论上,cDNA是长短不一的DNA片段,所以电泳的结果模糊一片,如果RNA丰度低,电泳也可能是无产物,但是这种情况不代表PCR会无结果。检测cDNA一般可以用内参基因,扩增有结果,说明cDNA的质量基本可以保证。

方法2——以反转录产物为模板,扩增已知的目的基因。如果有已知以此模板扩出来的基因,可以用此基因的引物验证。通常内参基因在cDNA中丰度高,很容易扩出。如果cDNA因为各种原因导致部分降解,从几率的角度讲,就会大大影响低丰度的目的基因的PCR结果,而内参因为依然是高丰度,扩增很可能不受影响。

 

2.   2. RT-PCR可以扩出内参基因而扩不出目的基因

RNA可能发生部分降解,检测提取RNA完整性及纯度。

RNA的完整性检测:不同物种的RNA情况可能不一样,但一般来说抽提成功的总RNA在凝胶电泳中应包含两条清晰的28S和18S条带,并且前者条带的亮度应是后者的两倍,出现明显的5S条带代表RNA发生降解,其亮度与降解程度成正比。内参基因扩增效果理想不能说明RNA没有问题,因为内参基因的表达量大,只要是RNA降解的不严重都可以扩出来。

RNA的纯度检测:纯RNA的OD260/OD280的比值应介于1.9-2.1之间,提取RNA的时候吸入少量蛋白会使比值降低,只要不是降的太多就不会影响反转录结果。

 

3.   3. 反转录反应是否成功?

内参基因能够扩增出来,仅仅说明反转录反应成功了,而与cDNA第一链的质量没有必然的联系。因为内参片段大小一般都比较小,而且表达量也比较高,在反转录时比较容易成功。而目的基因的大小与表达量可能存在很大的不同。特别是大于2kb的目的片段,更不能仅仅根据内参来判断cDNA质量。

 

4.   4. PCR反应是否成功?

内参基因的成功扩增只能说明模板cDNA是有效的,但即便是质量很好的cDNA模板,也不能保证目的基因的扩增结果理想,这还取决于该基因在该组织cDNA中正常表达量的多少。应检查所用模板的该目的基因的表达量或重新抽提RNA,以找到高表达目的基因的组织或细胞;对于已知表达水平低的目的基因,可以加大引物量或尝试用特异性引物进行反转录,即用下游引物替换随机引物进行反转录;另外,内参基因很容易扩出,内参基因的扩增条件不一定适合于目的基因,应根据设计的引物就PCR条件进行摸索。若PCR无法扩出目的基因,可以考虑进行热启动PCR。

 

5. 检测RNA水平进行相对定量时,是否需要在各样本RNA浓度一致的情况下再反转录成cDNA?

做相对定量时,必须首先在反转录前对RNA进行定量,这也是很多反转录试剂盒中所要求的,如RNA的使用量为1 μg。由于反转录后的cDNA是一种混合液,包括未完成反应的RNA、oligo dT、酶、dNTP、甚至还可能残留少许的DNA等,都会造成偏差,因此无法对cDNA进行准确定量,这就需要对RNA进行定量,认为不同样本间反转录效率相同,因此获得的cDNA产物量也相同,进而进行定量分析,其结果表示在相同量的总RNA中,不同基因的表达倍数关系。做相对荧光定量PCR时,反转录后可不用定量cDNA,因为有内参基因的Ct值进行均一化计算分析。


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