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发布时间:2021-07-19

无缝克隆是一种新型基因克隆技术,它可以同时将1到多个片段高效的插入到任何载体。目前应用较广泛的无缝克隆方法是Gibson Assembly和In-Fusion Cloning。这两种方法的在原理上非常相似:都是通过外切酶产生黏性末端、然后利用体内或体外重组酶进行连接,得到重组片段;但两者用到的酶却完全不同。我们一起来了解无缝克隆的秘密。


Gibson Assembly原理

Gibson Assembly是由Daniel Gibson和J.Craig Venter在2009年提出的。Gibson Assembly要求目的片段与线性化载体首尾具有一段互补重叠的同源臂序列;利用T5 exonuclease的5’一3’外切酶活性产生3’黏性末端,之后同源臂进行互补配对,再利用DNA polymerase延伸补齐片段上的缺口部分,最后通过Taq DNA Ligase连接DNA片段中的缺刻,完成克隆组装。


Gibson Assembly原理示意图


In-Fusion Cloning原理

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能够识别3’末端碱基,具有3’→5’外切酶活性的特点。通过In-Fusion酶产生5’黏性末端,互补重叠片段退火配对;再将重组片段转化到感受态细胞内,重组片段序列中的缺刻在菌体内进行连接,获得重组序列。



In-Fusion Cloning原理示意图


无缝克隆的优势

传统的分子克隆技术依赖于Ⅱ型限制性内切酶和T4 DNA连接酶的使用,DNA片段与载体经相同的限制性内切酶切割产生相同的末端,然后利用T4 DNA连接酶反应实现片段融合。这种方法受到酶切位点限制,需选择片段与载体序列内部没有、而仅在载体多克隆位点存在的酶切位点。酶切连接的方法一次只能连接单个片段,无法实现多片段同时连接。且该方法中T4 DNA连接酶的辅助因子ATP易失活,影响克隆效率。无缝克隆与传统的酶切连接相比,具有以下优势:

  • 不受酶切位点限制

  • 适用于任意载体、任意片段

  • 一步连接1或多个片段,连接多片段耗时短

  • 插入目的片段两端不会添加额外序列(如保护碱基)


无缝克隆实验关键影响因素

自无缝克隆技术被大家认识后,得到了众多老师的青睐,但同时也有部分质疑:连接效率为何总是不尽如人意?我们来细数影响无缝克隆实验的关键因素有哪些?

无缝克隆实验流程



片段质量

  • 确保DNA片段无核酸酶及其它酶污染、无乙醇等残留;

  • 纯度正常:A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰图正常;

  • 浓度正常:插入片段与线性化载体浓度高于50 ng/μl,会使重组效率提高;

  • 若模板浓度低、纯度低,则连接效率降低。


载体线性化方法

线性化载体可以选择反向PCR或酶切的方法:

  • 可根据在载体插入位置是否有合适的酶切位点选择具体方法。因Gibson Assembly反应体系内无双链DNA连接酶,不会发生载体自连,线性化载体不需要进行末端去磷酸化处理。酶切制备线性化载体建议使用双酶切,且酶切后采用胶回收的方法回收产物,这样利于降低假阳性。

  • 若没有合适酶切位点或者多次酶切制备线性化载体均不成功,可以选择反向PCR扩增,但不适合较大质粒,如超过8 kb。


引物设计

  • 目的片段引物设计:目的片段引物是由目的片段两端序列加同源臂序列组成,同源臂长度设置在16-45 bp,Tm值在58–65°C。同源臂越长,有利于重组置换,但可能会影响目的片段扩增;

  • 载体引物设计:确定目的片段插入位置,推荐借助Snapgene软件设计反向PCR引物。


PCR扩增

  • 反向PCR制备线性化载体及扩增目的片段时需要使用高保真酶;

  • 制备线性化载体后使用Dpn I内切酶消化环状质粒模板,降低假阳性克隆。


插入片段与线性化载体摩尔比

  • 10 µl 反应体系,载体与插入片段总加入量建议在 0.01-0.3 pmol。插入片段与线性化载体的最佳摩尔比为 1:1-4:1;片段与片段的摩尔比为1:1。

  • 推荐使用GenStar 克隆连接反应体系计算工具,快速计算载体与目的片段使用量。


感受态转化效率

  • 插入片段与载体全长超过10 kb,属于长片段克隆,应使用高效感受态;如:转化效率大于108 cfu/μg DNA的感受态细胞。

  • 感受态细胞与重组质粒用量比例不小于10:1。


只要注意以上几点,高效无缝克隆实验轻松get。


什么?不清楚无缝克隆实验具体怎样操作?

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GenStar以Gibson Assembly原理为基础,推出的两个系列无缝克隆产品具有以下优势:


  • 无痕:不会添加额外序列即可插入到任何载体;

  • 高效:阳性率高达 95%,操作简单;

  • 兼容:不同克隆系统之间转换方便,不受载体末端(平/粘性)的限制和限制性内切酶位点的影响;

  • 快速保真:HiFi 系列所特有,50℃反应,单个片段连接 15 min 内完成,多个片段连接 30 min 内完成。可用来定点突变;

  • 灵活:Flex 系列所特有,反应温度(常温)、反应时间灵活。可用来构建突变载体文库。


GenStar 无缝克隆产品列表


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