无缝克隆是一种新型基因克隆技术，它可以同时将1到多个片段高效的插入到任何载体。目前应用较广泛的无缝克隆方法是Gibson Assembly和In-Fusion Cloning。这两种方法的在原理上非常相似：都是通过外切酶产生黏性末端、然后利用体内或体外重组酶进行连接，得到重组片段；但两者用到的酶却完全不同。我们一起来了解无缝克隆的秘密。

Gibson Assembly原理

Gibson Assembly是由Daniel Gibson和J.Craig Venter在2009年提出的。Gibson Assembly要求目的片段与线性化载体首尾具有一段互补重叠的同源臂序列；利用T5 exonuclease的5’一3’外切酶活性产生3’黏性末端，之后同源臂进行互补配对，再利用DNA polymerase延伸补齐片段上的缺口部分，最后通过Taq DNA Ligase连接DNA片段中的缺刻，完成克隆组装。

Gibson Assembly原理示意图

In-Fusion Cloning原理

In-Fusion Cloning利用了In-Fusion酶能够识别3’末端碱基，具有3’→5’外切酶活性的特点。通过In-Fusion酶产生5’黏性末端，互补重叠片段退火配对；再将重组片段转化到感受态细胞内，重组片段序列中的缺刻在菌体内进行连接，获得重组序列。

In-Fusion Cloning原理示意图

无缝克隆的优势

传统的分子克隆技术依赖于Ⅱ型限制性内切酶和T4 DNA连接酶的使用，DNA片段与载体经相同的限制性内切酶切割产生相同的末端，然后利用T4 DNA连接酶反应实现片段融合。这种方法受到酶切位点限制，需选择片段与载体序列内部没有、而仅在载体多克隆位点存在的酶切位点。酶切连接的方法一次只能连接单个片段，无法实现多片段同时连接。且该方法中T4 DNA连接酶的辅助因子ATP易失活，影响克隆效率。无缝克隆与传统的酶切连接相比，具有以下优势：

• 不受酶切位点限制

• 适用于任意载体、任意片段

• 一步连接1或多个片段，连接多片段耗时短

• 插入目的片段两端不会添加额外序列（如保护碱基）

无缝克隆实验关键影响因素

自无缝克隆技术被大家认识后，得到了众多老师的青睐，但同时也有部分质疑：连接效率为何总是不尽如人意？我们来细数影响无缝克隆实验的关键因素有哪些？

无缝克隆实验流程

片段质量

• 确保DNA片段无核酸酶及其它酶污染、无乙醇等残留；

• 纯度正常：A260/A280值在1.6-1.9、A260/230值在2左右、紫外吸收峰图正常；

• 浓度正常：插入片段与线性化载体浓度高于50 ng/μl，会使重组效率提高；

• 若模板浓度低、纯度低，则连接效率降低。

载体线性化方法

线性化载体可以选择反向PCR或酶切的方法：

• 可根据在载体插入位置是否有合适的酶切位点选择具体方法。因Gibson Assembly反应体系内无双链DNA连接酶，不会发生载体自连，线性化载体不需要进行末端去磷酸化处理。酶切制备线性化载体建议使用双酶切，且酶切后采用胶回收的方法回收产物，这样利于降低假阳性。

• 若没有合适酶切位点或者多次酶切制备线性化载体均不成功，可以选择反向PCR扩增，但不适合较大质粒，如超过8 kb。

引物设计

• 目的片段引物设计：目的片段引物是由目的片段两端序列加同源臂序列组成，同源臂长度设置在16-45 bp，Tm值在58–65°C。同源臂越长，有利于重组置换，但可能会影响目的片段扩增；

• 载体引物设计：确定目的片段插入位置，推荐借助Snapgene软件设计反向PCR引物。

PCR扩增

• 反向PCR制备线性化载体及扩增目的片段时需要使用高保真酶；

• 制备线性化载体后使用Dpn I内切酶消化环状质粒模板，降低假阳性克隆。

插入片段与线性化载体摩尔比

• 10 µl 反应体系，载体与插入片段总加入量建议在 0.01-0.3 pmol。插入片段与线性化载体的最佳摩尔比为 1:1-4:1；片段与片段的摩尔比为1:1。

• 推荐使用GenStar 克隆连接反应体系计算工具，快速计算载体与目的片段使用量。

感受态转化效率

• 插入片段与载体全长超过10 kb，属于长片段克隆，应使用高效感受态；如：转化效率大于108 cfu/μg DNA的感受态细胞。

• 感受态细胞与重组质粒用量比例不小于10:1。

   

只要注意以上几点，高效无缝克隆实验轻松get。

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